Während ihres Studiums arbeitete sie als Assistentin an einer psychiatrischen Klinik und ab 1896 für zwei Jahre als Ärztin in der kinderpsychiatrischen Abteilung der römischen Universitätsklinik. Im Umgang mit geistig behinderten Kindern entwickelte sie Sinnesmaterialien, die zusammen mit medizinischen Erkenntnissen Grundlage für ihre Pädagogik wurden. Montessori arbeitete in den folgenden Jahren erfolgreich als Dozentin der Lehrerbildungsanstalt und Direktorin eines heilpädagogischen Instituts in Rom. Nach der Geburt ihres Sohnes Mario gab sie die Lehrtätigkeit auf und studierte Anthropologie und Psychologie und wurde 1904 als Professorin für Anthropologie an die Universität Rom berufen. Nachdem sie 1907 das erste Kinderhaus in einem Vorort Roms leitete, in dem nach ihren Methoden Kinder aus der „unterprivilegierten“ Arbeiterschicht unerwartete Fortschritte und Lernerfolge zeigten, verbreitete sich die Pädagogik der Maria Montessori weltweit.

Viele Vortragsreisen durch Europa und Amerika, längere Auslandsaufenthalte, eine Vielzahl an Publikationen und internationale Lehrgänge zur Ausbildung von Lehrkräften in ihrer Methode prägten die nächsten Jahre ihres Lebens. 1922 wurde Maria Montessori zur Regierungsinspektorin der Schulen Italiens ernannt. Die totalitären Regime in Europa und der Sowjetunion bremsten die weitere Ausbreitung der Montessorischulen. In Deutschland wurden während des Nationalsozialismus alle Montessori-Einrichtungen geschlossen, aber auch der italienische Faschismus behinderte das Werk Montessoris. Ab 1934 lebte Montessori zunächst in Spanien, dann wegen des Bürgerkriegs ab 1936 in den Niederlanden und später in Indien, wo sie unermüdlich gemeinsam mit ihrem Sohn an ihrem Lebenswerk arbeitete. 1947 kehrte sie in die Niederlande zurück und starb dort im Mai 1952.